CRISPR-Cas9 tehnika - molekularne makaze

Da bi se aktivirali i razmnožili virusima je potreban domaćin, živ organizam, što praktično znači da su bez ćelije nekog organizma virusi neaktivni. Neko vreme se zbog toga mislilo da virusi ne pripadaju živim organizmima, ili da su deo nežive materije na prelazu u živu. Činjenica da poseduju genetički, nasledni materijal, dovodi ih u ravan sa živim organizmima.


Virusi su izgrađeni od samo dve komponente. Jednu predstavlja nukleinska kiselina DNK(RNK), a drugu omotač proteinske prirode. Infiltrirajući se u ćeliju domaćina virus vrlo inteligentno koristi njen mehanizam ( enzime, ribozome i energiju ) za sintezu sopstvenih proteina i vrlo brzo se razmnožava zahvaljujući sposobnosti da u jednom ciklusu razmnožavanja može da reprodukuje preko hiljadu novih virusnih čestica. Novi virusi odmah prelaze na neinficirane ćelije.
Pre nekoliko godina je otkriveno da virusi u napadu na domaćina koriste taktiku koju koriste insekti, to jest novi virusi preskaču ćelije koje su već inficirane i fokusiraju se na zdrave ćelije. Ovo štedi energiju, a ubrzava infekciju oko 5 puta. Da bi se znalo koja je ćelija inficirana virus ostavlja dva proteina na površini ćelije kao znak da je ta ćelija već napadnuta.

Viruse razlikujemo prema domaćinu na kome parazitiraju. Obzirom da su bakterije najbrojniji ćelijski organizmi logično su one najbrojniji domaćini virusa. Virus koji napada bakterije se naziva fag, i iako je jednostavne građe, njegova je razorna snaga neverovatna. Ako se u koloniju 10 milijardi bakterije E coli ubaci samo jedan fag( virus ) za 2 sata ostaje samo 0,1% živih bakterija, a fag virus se razmnoži do cifre 10 triliona.

Svakodnevna borba za preživljavanje bakterija i virusa dovela je do neverovatnih mehanizama napada i odbrane, pa čak i saradnje. Mnogi od tih postupaka su impresivni kompleksi informatičkih upustava, pa ne čudi da fascinantni stvarački procesi po svojoj mastovitosti automatski podsete na inteligenciju. Ako se držimo teorije evolucija u pitanju je tek porast količine genetičkih informacija.

Tema ovog teksta je jedan takav postupak koje koriste bakterije kako bi se obranile od napada virusa, a od nedavno se koristi u geoinženjeringu kao CRISPR-Cas9 tehnika, za precizno izrezivanje genoma na određenim tačkama. Treba napomenuti da nemaju sve bakterije ovaj odbrambeni mehanizam. Karakterističan je za archea bakterije.

Tehnika je već eksperimentalno korištena. Nažalost, poslednja istraživanja sa Univerziteta Stanford ukazuju da bi " Reakcija imunološkog sistema na genetsku terapiju zasnovanu na CRISPR tehnologiji mogla bi da ometa njegovu bezbednu i efikasnu upotrebu, pa čak i dovede do značajnog stepena toksičnosti u organizmu pacijenata". Reči su to doktora Metju Porteusa, vodećeg autora projekta analiza krvi i mogućnosti primene ove tehnologije na ljudima.

Zašto smo imuni na ovu vrstu tehnologije?

Najpopularnije verzije Cas9 proteina potiču od dve različite vrste bakterije - stafilokoke i streptokoke, kojima se ljudi redovno inficiraju. To znači da su naša tela već dobro upoznata sa njima. Sada se planira rad na novim CRISPR sistemima, koji će početi kada bude pronađena bakterija sa kojom ljudski organizam nikad nije imao dodira. Razmatra se i mogućnost izvlačenje ćelija iz ljudskog organizma, njihovo tretiranje CRISPR tehnologijom i vraćanje nazad u organizam.

Nadalje, ova tehnika ima i neke mane: često se dešava da dođe do tzv. "off-target" mutacija, kada, ispravljajući jednu grešku, napravimo neku drugu, na nekom drugom mestu na genomu. Upravo strah od off-target mutacija sprečava naučnike da više rade sa CRISPR na području humane genetika,  Bez detaljnih screening-testova, ne može se znati da li je došlo do promena i ako jeste, šta te mutacije mogu napraviti organizmu.  Ponekad i naizgled benigne promene mogu imati kobne posledice.

1980-ih naučnici su uočili da se neki delovi DNA bakterija više puta ponavljaju na neobičan način te da između njih uobičajeno dolaze neki jedinstveni međunizovi. Ovakva neobična konfiguracija nazvana je “clustered regularly interspaced short palindromic repeats,” odnosno CRISPR. Istraživanja su pokazala da CRISPR sadrži segmente genskog koda neprijateljskih virusa s kojima se bakterija ranije susrela te da je on važan deo odbrambenog sistema bakterije. Na osnovu tog koda bakterija prepoznaje uljeza i pokreće efikasan napad na njega. Enzimi Cas (CRISPR-associated proteins) predstavljaju drugi deo tog sistema. Bakterija će spomenute delove neprijateljskog virusa kopirati u relativno kratke poruke RNA 'voditeljice' i pridružiti im odgovarajuće enzime Cas. Takvo oružje će se umnožiti i 'patrolirati' ćelijom bakterije. Kada naiđe na isti kod u nukleinskoj kiselini virusa, Cas će ga odmah preseći na prepoznatom mestu kako bi onemogućio njegovo umnožavanje.


Postoje mnoge metode genetskog inžinjeringa ali većina njih je jako kompleksna, neprecizna ili je previše skupa da bi se izvodila na masovnom nivou. Dugo je san naučnika bio da se nađe metoda koja bi sva ova 3 kompleksna problema prevazišla, i san im se konačno ispunio kada je predstavljena nova CRISPS metoda.

CRISPS

1. Virus napada bakterijsku stanicu; 2. Nukleinska kiselina virusa ugrađuje se u bakterijsku nukleinsku kiselinu na mestu CRISPR; 3. CRISPR RNA kompleks je formiran; 4. CRISPR RNA vezuje se sa Cas9 enzimom; 5. CRISPR RNA vodi Cas9 enzim do virusa. On reže i uništava viralni genom.

 Isečeno mesto je prazno i pošto ćelija poseduje mehanizme reparacije naslednog materijala, ona to upravo i čini, čime se prazno mesto popunjava.

Istom tehnikom naučnici mogu da odseku deo DNK, poprave oštećeni gen ili  ubace novi.  Čitava ova metoda je jako brza i jeftinija od svih do sada postojećih, a funkcioniše sa izuzetnom preciznošću.

Otkriće 

" Kako je taj bakterijski sistem prilagođen za razvoj nove genske tehnologije? Godine 2012, tim Jennifer Doudna sa Univerziteta  California Berkeley, SAD; i Emmanuelle Charpentier, tada sa švedskog Univerziteta  Umea, modifikovali su i spojili zajedno kratke RNA molekule u jednu vodeću RNA (slika 2). To je omogućilo da se jedan kraj vodeće RNA poveže sa Cas9 enzimom, dok sekvenca na drugom kraju lanca može stvarati vezu s bilo kojom ciljnom DNA. Takva prilagodljivost, omogućila je da CRISPR-Cas9 specifično reže izabrani DNA sled.


Opis korištenja tehnike na ljudskim ćelijama

Nedugo nakon toga, laboratorij Feng Zhang-a Instituta za tehnologiju Massachusetts, SAD, koristili su CRISPR-Cas9 tehnologiju pokazavši njezin efekat u potaknutom preciznom genskom rezanju stanica čoveka i miša (Cong et al, 2013). Dodatno, podesili su Cas9 enzim kako bi mogao rezati DNA na malo drugčiji način, simulirajući specifičan mehanizam popravka DNA u stanicama. To znači da su naučnici uspešno ugradili novu DNA sekvencu u izrezano mesto, zamenivši pritom originalnu sekvencu (slika 2)." izvor 

Science Magazine je 2015. proglasio CRISPR tehniku najvećim dostignućem nauke u protekloj dekadi.

                              2. Uređivanje gena(engl. gene editing) koristeći CRISPR-Cas9.

                              A: Ciljna sekvenca; B:DNA; C:Vodeća RNA; D:Cas9; E:Nova DNA sekvenca

1. Vodeća RNA veže se sa ciljnom DNA sekvencom; 2. Cas9 enzim povezuje se sa vodećom RNA; 3. Cas9 enzim kida oba lanca DNA; 4. Bakterijski mehanizam popravka uvodi novu DNA na mesto prekida lanca, zamenjujući originalnu DNA sekvencu.

                                                                    SNIMAK REZANJA DNK

Prošle godine naučnici su uspeli da snime zapanjujuću aktivnost CRISPR-a na lancu DNK. Kratki video u trajanju od nekoliko sekundi beleži interakciju molekula dok protein kida genski kod.

 

VIDI : detaljnije 

              Single-molecule movie of DNA search and cleavage by CRISPR-Cas9.